Analiza benzodiazepin, zarówno tych powszechnie stosowanych, jak i tzw. „designer drugs”, czyli modyfikowanych chemicznie wersji klasycznych substancji, staje się coraz bardziej istotnym zagadnieniem współczesnej toksykologii i medycyny sądowej. Dzięki pracy ekspertów takich jak Emily Lee i Boris Lazarov, możliwe jest opracowanie skutecznych, szybkich i precyzyjnych metod wykrywania tych związków w różnych typach próbek biologicznych, co ma ogromne znaczenie zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i w badaniach sądowych.
Zespół kierowany przez Emily Lee opracował nowoczesną metodę analityczną o wysokiej wydajności – opartą na technologii UPLC-MS/MS i zastosowaniu płytek Oasis MCX μElution, które wykorzystują uproszczoną metodę ekstrakcji fazy stałej (SPE). Metoda obejmuje aż 26 różnych benzodiazepin, zarówno tych klasycznych, jak i syntetycznych, zapewniając ich pełną separację w czasie krótszym niż cztery minuty. Co kluczowe, w procesie użyto stabilnych izotopowo standardów wewnętrznych, co pozwala na wysoką dokładność i powtarzalność wyników w różnych próbkach moczu.
Z kolei Boris Lazarov skoncentrował się na optymalizacji procedur dla materiału szczególnie wymagającego, jakim jest krew pośmiertna. Jego podejście bazowało na szybkim i skutecznym strącaniu białek oraz zautomatyzowanym rozcieńczaniu próbki w autosamplarze. Dzięki temu udało się osiągnąć bardzo wysoką czułość – nawet na poziomie 1 ng/mL – przy wykrywaniu takich związków jak fluorowane benzodiazepiny czy brotizolam. Warto zaznaczyć, że badania te są nieocenione w toksykologicznej analizie przypadków śmierci o niejasnej etologii, czy zatruć przy użyciu leków z czarnego rynku.
Wybór substancji, które powinny wchodzić w skład panelu analitycznego, oparty był zarówno na literaturowych doniesieniach o częstotliwości ich występowania, jak i realnych wynikach analiz laboratoryjnych. Na przykład brotizolam zyskał wysoką pozycję w zestawieniu ze względu na jego rosnącą obecność w próbkach pacjentów. Takie podejście gwarantuje, że metodyka pozostaje aktualna i odpowiada na realne zagrożenia.
W sytuacji, gdy laboratorium chce dodać nową substancję do swojego panelu analitycznego, eksperci zgodnie zalecają rozpoczęcie od optymalizacji warunków spektrometrii mas, a następnie ocenę parametrów ekstrakcji i okresu retencji. Jeżeli wszystko mieści się w akceptowalnych granicach, nowy związek można bez większych trudności włączyć do już istniejącej procedury.
Pod względem wydajności ekstrakcji, metoda opracowana przez Emily Lee wykazała się znakomitym wynikiem – średni odzysk 86% przy niewielkich efektach matrycowych. Co istotne, różnice w uzyskach dotyczyły głównie tych związków, dla których nie dysponowano izotopowo znakowanymi standardami – takich jak etizolam. W przypadku metody Lazarova, choć odzysk był nieco niższy (od 50 do 77%), to i tak osiągnięto bardzo dobrą czułość i precyzję.
Kwestia stabilności związków, szczególnie tych z grupy designer benzos, okazała się wyjątkowo trudna. Fluorowane benzodiazepiny ulegały degradacji już po jednym dniu przechowywania w temperaturze –20°C, co jasno wskazuje, że każda pracownia musi dodatkowo przetestować własne warunki przechowywania próbek, aby uniknąć fałszywie zaniżonych wyników analitycznych.
Czas przygotowania próbki metodą SPE wynosił około 1–1,5 godziny dla 20 próbek, przy wykorzystaniu ręcznego pipetowania i wielokanałowego systemu przygotowania. Potencjalne wdrożenie automatyzacji znacząco skróciłoby ten czas i umożliwiło zwiększenie przepustowości laboratorium. Co więcej, sposób opracowania procedury – w tym hydrolysis, zakwaszanie i elucja – realizowany był w jednym 96-dołkowym zestawie, co sprzyja w pełni zautomatyzowanym procesom.
Interesującym aspektem było potwierdzenie, że klasyczna kolumna chromatograficzna typu C18 nadal sprawdza się najlepiej w analizie benzodiazepin. Zarówno Emily Lee, jak i Boris Lazarov nie widzieli potrzeby używania innych faz stacjonarnych, argumentując to odpowiednią hydrofobowością analizowanych związków.
W zależności od potrzeb danego laboratorium oraz rodzaju analizowanych próbek, można rozważyć także inne techniki przygotowania – na przykład bardziej czasochłonną, ale „czystszą” SPE zamiast strącania białek, jeśli próbki są trudne lub wymagają wysokiej dokładności (np. w analizie potwierdzającej w medycynie klinicznej).
Zarówno zastosowanie automatyki w autosamplerze (np. do rozcieńczania próbki), jak i możliwość pełnej integracji workflow SPE z platformami automatyzacji laboratoryjnej, otwiera nowe możliwości dla laboratoriów analizujących duże liczby próbek przy zachowaniu wysokiej precyzji.
Plany na przyszłość również zapowiadają się interesująco. W przypadku Emily Lee, przewidywane są prace nad rozszerzonym panelem leków stosowanych w nadużyciach w analizie włosów – co potencjalnie obejmie również benzodiazepiny. Dla laboratorium kierowanego przez Boris Lazarova priorytetem pozostają rutynowe matryce, takie jak krew i mocz, ale badacz wskazuje, że przy niewielkich zmianach metody, można ją z powodzeniem adaptować także do innych typów próbek.
Postęp w analizie benzodiazepin, zarówno typowych, jak i nowo powstających substancji, stanowi kluczowy element skutecznej diagnostyki toksykologicznej. Innowacyjne podejścia, nowoczesne instrumentarium i ciągłe dostosowywanie się do zmieniającego rynku substancji psychoaktywnych pozwala nie tylko trafniej diagnozować pacjentów, ale także skuteczniej monitorować ryzyko związane z nadużywaniem leków i substancji odurzających.
